Thérapie Génique (résumé cours 2 et 9 juin 2015)

La connaissance moléculaire du support de l’hérédité, les gènes et leurs éléments régulateurs ont conduit naturellement à envisager de modifier le génome cellulaire dans un but thérapeutique : dans un premier lieu, corriger une maladie héréditaire attribuable à la mutation d’un gène en apportant au sein des cellules une copie fonctionnelle du gène. Cette idée a émergé dans les années 1970 au moment où il devint envisageable d’utiliser des virus modifiés comme vecteurs de la séquence génétique d’intérêt thérapeutique. Aujourd’hui, la thérapie génique peut aussi se concevoir comme un moyen d’inhiber l’expression d’un gène muté délétère, de modifier l’expression d’un gène muté, d’ajouter un nouveau gène pour créer une nouvelle fonction ou même de corriger directement une mutation.

Rendre effective une thérapie génique implique, outre le gène d’intérêt, d’apporter une séquence promotrice qui régule l’expression du gène thérapeutique et d’utiliser un vecteur. Les défis à relever sont complexes, expliquant le lent développement de cette approche : il faut tout à la fois cibler la cellule pertinente, obtenir un niveau d’expression adéquat (ni trop, ni trop peu) du gène d’intérêt, éviter un effet toxique et une réaction immune contre le vecteur et/ou le transgène. Deux stratégies sont globalement utilisées fondées d’une part sur des vecteurs qui permettent l’intégration du gène d’intérêt dans le génome cellulaire et donc sa réplication à chaque division cellulaire, d’autre part sur la persistance du gène d’intérêt sans intégration, ce qui évite tout risque de génotoxicité. Ces derniers vecteurs ne peuvent être utilisés que pour cibler des cellules qui ne se divisent pas ou peu. La première catégorie de vecteurs est représentée par les rétrovirus dont l’ARN après rétro transcription en ADN s’intègre dans le génome cellulaire. La seconde est essentiellement représentée par les adeno associated virus (AAV) qui pénètrent dans toutes les cellules et dont le matériel génétique peut persister à l’état d’épisome.

L’utilisation de rétrovirus s’est développée dans les années 1980. Des lignées productrices de virus non réplicatifs ont été produites et ces virus testés pour leur capacité à apporter un gène d’intérêt dans les lignées hématopoïétiques. Ces travaux ont jeté les bases des premiers succès de la thérapie génique obtenus en corrigeant des pathologies dénommées déficit immunitaire combiné sévère (DICS). Celles-ci représentent en effet une situation particulièrement favorable : elles consistent en un défaut de développement des lymphocytes T lié à la mutation d’un gène. On sait que peu de cellules précurseurs des lymphocytes T peuvent générer un très grand nombre de lymphocytes T dont la durée de vie est très longue (plusieurs dizaines d’années !). Ainsi la correction ex vivo à l’aide d’un vecteur rétroviral d’un petit nombre de précurseurs de lymphocytes T (de l’ordre de 1 000) peut suffire à corriger ce déficit immunitaire. C’est ce qui a été démontré pour deux DICS avec un recul qui dépasse aujourd’hui 16 ans. Néanmoins, ces premiers succès ont aussi été marqués par la survenue chez certains malades de leucémie, complication inhérente aux caractéristiques des premiers vecteurs rétro viraux utilisés. La modification de ceux-ci, en retirant une séquence dite enhancer capable d’activer un gène du génome cellulaire tel qu’un oncogène, a conduit à la génération de nouveaux vecteurs dont l’emploi depuis huit ans apparaît comme sur et efficace. Le développement de vecteurs rétroviraux plus efficaces – dérivés des lentivirus comme le virus d’immunodéficience humaine (VIH) – permet aujourd’hui de traiter des pathologies héréditaires de la moelle osseuse pour lesquelles il est nécessaire de corriger un beaucoup plus grand nombre de cellules-souches hématopoïétiques (CSH). Des résultats encourageants ont été obtenus dans le traitement de 6 maladies (déficits immunitaires, mais aussi maladies métaboliques et hémoglobinopathies), ce qui ouvre des perspectives de développement de cette approche dans le traitement d’autres pathologies héréditaires de la moelle osseuse. La même stratégie (vecteurs rétroviraux) est aussi utilisée pour conférer à des lymphocytes T la capacité de reconnaître et tuer certaines cellules cancéreuses. Dans ce cas, un gène artificiel composé d’un module de reconnaissance d’une molécule membranaire de cellules cancéreuses et d’un module de transmission de signaux d’activation cellulaire est introduit ex vivo dans des lymphocytes T autologues issus du sang. Des résultats prometteurs ont été obtenus dans le ciblage de lymphomes et leucémies B par des lymphocytes T exprimant un « CAR » (chimeric antigen receptor). Cette stratégie est susceptible de s’appliquer à d’autres tumeurs comme le glioblastome ou le mésothéliome.

– L’utilisation de vecteurs AAV (cf. supra) offre une plateforme d’intervention in vivo pour cibler des cellules post-mitotiques. De tels vecteurs peuvent être produits en très grande quantité, leur limite tient à la taille du matériel génétique qui puisse être encapsidée dans la particule virale (< 5 kbases) et au risque d’immunogénicité dans la mesure où l’homme est naturellement infecté par des virus AAV. C’est ce qui a été observé lors des premières tentatives d’application dans le domaine de l’hémophilie B où la réponse immune anti AAV des patients a rapidement annihilé la production de facteur IX (déficient dans l’hémophilie B) de la coagulation par des cellules hépatiques modifiées. Le recours à des types d’AAV moins souvent responsables d’infection chez l’homme semble circonvenir cette difficulté. Ainsi il est devenu possible d’obtenir après injection par voie veineuse de vecteur AAV, la production stable pendant au moins 3 ans d’une quantité suffisante de facteurs IX de la coagulation de telle sorte que les patients n’aient que peu ou pas recours à un traitement substitutif. Des vecteurs similaires sont testés pour traiter des maladies héréditaires de la rétine responsables de cécité. La technique implique une injection sous rétinienne de particules virales susceptibles d’infecter (et corriger) les cellules rétiniennes pathologiques. Des résultats préliminaires encourageants ont été obtenus dans le traitement de certaines de ces maladies comme la maladie de Leber, même si la correction visuelle observée est partielle et semble s’amoindrir avec le temps. Il faut noter que cette approche provoque une réaction inflammatoire locale tolérable. D’autres pathologies font l’objet d’approche thérapeutique utilisant des vecteurs AAV : maladies métaboliques du foie, maladie de surcharge cérébrale, myopathies.

Une stratégie distincte de thérapie génique consiste en l’emploi d’oligonucléotides inhibiteurs soit de l’expression d’un gène délétère, soit de l’épissage d’un gène muté. Cette seconde approche permet d’éliminer du produit final un exon porteur d’une mutation délétère. De gros efforts ont été entrepris dans le cadre de la myopathie de Duchenne. L’objectif est de transformer une forme sévère de la maladie en une forme modérée – compatible avec la vie à l’âge adulte – par modification de l’épissage du gène. Les résultats obtenus à ce jour sont encore modestes mais le développement de nouveaux oligonucléotides modifiés qui favorisent leur pénétration cellulaire, leur liaison à l’ARN messager et leur stabilité confère l’espoir que cette stratégie puisse aboutir.

D’autres approches de thérapie génique cherchent à vectoriser le matériel génétique d’intérêt dans des vecteurs non viraux par association à des lipides sous forme de liposomes ou nano particules ou par association à différents types de polymères. Le défi consiste à faire pénétrer le matériel génétique au sein des noyaux sans dégradation excessive ni toxicité. Ce résultat n’a pas encore été obtenu de façon probante lors d’essais cliniques.

Le ciblage génique à l’aide d’enzyme capable de corriger l’ADN à un site précis apparaît comme une stratégie prometteuse même si elle n’a pas atteint un stade d’application clinique. Il est déjà possible d’inactiver l’expression d’un gène en induisant une cassure ciblée suivie d’une réparation, source de mutation inactivatrice. Cela a été testé pour induire l’inactivation du récepteur membranaire du virus HIV (CCR5) à la surface de cellules sanguines. Plus complexe est l’approche consistant à introduire au lieu de cassure ciblée tout ou partie d’un gène d’intérêt. La réparation de l’ADN par un système fidèle : la recombinaison homologue rend cette approche faisable ce d’autant qu’ont été développés des enzymes (endonucléases) capables de corriger l’ADN de façon très spécifique (système d’endonucléase à doigt de zinc, de Talen et surtout CRISPR-Cas 9 dont la spécificité est conférée par une séquence complémentaire de l’ADN qui place l’enzyme Cas 9 à l’endroit précis ciblé. De telles stratégies permettent soit de placer un gène d’intérêt dans une zone neutre (sans danger) du génome soit de réparer exactement une mutation de telle sorte que le gène « thérapeutique » est placé dans son environnement physiologique. Si le concept est séduisant, il doit cependant affronter deux difficultés qui ne sont encore que partiellement résolues : l’efficacité très limitée de correction – en particulier dans les cellules qui ne se divisent pas ou peu – comme les cellules-souches (exemple des CSH) et le risque de toxicité inhérent à une modification du génome hors cible.

La thérapie génique est encore à une phase initiale, mais la preuve d’efficacité de cette approche a été apportée pour un petit nombre (n = 8) de maladies héréditaires et de cancer (n = 2). Fondées sur l’analyse des succès (et des échecs), les technologies évoluent rapidement et devraient faire en sorte que la thérapie génique intègre pour certaines pathologies héréditaires et acquises l’arsenal thérapeutique disponible. Les questions de développement à grande échelle et donc d’industrialisation ne sont cependant pas à ce jour entièrement résolues.