François Jacob effectua toutes ses recherches dans les laboratoires de l’Institut Pasteur, y compris après son élection au Collège de France.
Son œuvre scientifique se répartit en trois périodes :
De 1950 à 1958, il se consacre à l’étude de la lysogénie bactérienne (état d'une bactérie ayant intégré une partie du matériel génétique d'un virus bactériophage) et au concept de provirus ou prophage, génome dormant intégré à celui de la bactérie hôte. Avec Élie Wollman, il mène également des recherches consacrées à la conjugaison bactérienne, travaux qui donneront lieu à la publication en 1961 de leur ouvrage Sexuality and The Genetics of Bacteria.
De 1958 à 1970, leurs recherches convergeant, il s’associe à son collègue pasteurien Jacques Monodpour explorer l'idée selon laquelle le contrôle des niveaux d'expression enzymatique dans les cellules résulte de la régulation de la transcription des séquences d'ADN. En 1958, l’expérience PaJaMo (pour Pardee – Jacob – Monod) démontre que les bactéries synthétisent un inhibiteur pour réprimer la production de la bêta-galactosidase. Jacob et Monod finissent par mettre en évidence la régulation du gène chez Escherichia coli et énoncent le modèle de l’opéron, préfigurant l’existence de l’ARN messager. Ils reçoivent ainsi en 1965 avec André Lwoff le prix Nobel pour la découverte de la mécanique de la synthèse des protéines et du système de régulation qui préside à cette synthèse.
De 1970 à 1991, François Jacob travaille sur le tératocarcinome et sur l’embryon de la souris. Il souhaite ainsi comprendre, au niveau moléculaire, la complexité des organismes supérieurs, le développement embryonnaire et le cancer.
Ses cours au Collège de France (1964-1991) refléteront toutes ces recherches.
Les dernières décennies de sa vie sont encore consacrées à la publication d’ouvrages d’histoire et d’épistémologie des sciences, dont l’influence demeure importante (La Logique du vivant, Le Jeu des possibles puis La Souris, la Mouche et l’Homme).